۲۱۷۶پ

The assessment of the role of Calcineurin B-like protein (CBL) gene in Tomato (Solanum lycopersicum L.) in response to drought stress using virus induced gene silencing (VIGS)

دكتري تخصصي ( Ph.D)

زيست شناسي - فيزيولوژي گياهي

دانشگاه پيام نور تهران شرق

۱۳۹۶

۱۳۹۶/۱۰/۲۵

عالي

۳۰۱ص.

ابراهيمي ، محمد علي - حسيني تفرشي ، سيدعلي

حائري نسب ، مريم - انتشاري ، شكوفه

۲۴۳-۲۷۹

"پروتئين‌هاي شبه كلسي‌نورين B" كه به اختصار آن‌ها را CBL مي‌نامند، خانواده‌اي از حسگرهاي كلسيمي هستند كه به سبب شباهت‌ بخشي از ساختارشان با زيرواحد تنظيمي B در كلسي‌نورين فسفاتازهاي جانوري، به اين نام معروف شده‌اند. اين پروتئين‌ها هم از نظر فيزيكي و هم از نظر عملكردي با گروه ويژه‌اي از پروتئين‌ها، موسوم به"پروتئين‌هاي كيناز‌ي برهم‌كنش‌گر با CBL (CIPK) تعامل داشته و فعاليت كينازي آن‌ها را تنظيم مي‌كنند. امروزه مشخص شده است كه شبكه CIPK-CBL، ارائه‌كننده يك مكانيسم متفاوت رمزگشايي +Ca2 مي‌باشد كه در گياهان به گونه‌اي منحصر به فرد عمل مي‌نمايد. در اين مسير، هر CBL با زير مجموعه‌اي از CIPKها برهمكنش داشته و به صورت متقابل، هر CIPK با يك يا تعداد بيشتري از CBLها برهم‌كنش نشان مي‌دهد. اين امر ممكن است شاهدي بر وجود عملكرد اختصاصي بالا و گستردگي عملكرد اين پروتئين‌ها باشد در سال‌هاي اخير نقش اين پروتئين‌ها در ايجاد مقاومت به تنش‌ها و از جمله خشكي در گياهان مورد توجه قرار گرفته است. در تحقيق حاضر، تلاش شده تا با استفاده از رويكردهاي بيوانفورماتيكي، تمامي ژن‌هاي كدكنندهCBL با درجه حفاظت‌شدگي بالا، در گياه گوجه‌فرنگي شناسايي و مورد بررسي ساختاري و عملكردي قرار گيرد. در ادامه با بهره‌گيري از يك سيستم مبتني بر ارتوژني، اين پروتئين‌ها به 5 كلاس مجزا تقسيم‌بندي و نامگذاري شدند. همچنين جايگاه‌هاي حضور و موارد تكرار عناصر شاخص‌ پاسخ دهنده به تنش خشكي در ناحيه‌اي يك كيلو جفت بازي در بالادست كدون آغازين ژن‌ها بر روي پروموتور مورد بررسي قرار گرفت. در نهايت دو ژن CBL3-1 و CBL3-2 كه واجد بيشترين و كمترين شمار عناصر پاسخ به خشكي بودند، انتخاب و عملكرد آن‌ها در پاسخ به تنش خشكي با استفاده از روش خاموش¬سازي ژن به روش القايي توسط ويروس (VIGS) مورد بررسي قرار گرفت. از سويي به منظور بررسي اثر ذاتي مقاومت گياه در كيفيت پاسخ ژن‌هاي CBL به تنش خشكي و مقايسه نحوه ارائه پاسخ در ارقام حساس و مقاوم گياهان، با انجام يك‌سري آزمايش‌هاي گزينشي بر پايه مطالعات رشدي، فيزيولوژي و بيوشيميايي، نسبت به انتخاب دو رقم نسبتاً حساس و مقاوم گوجه‌فرنگي از ميان 14 رقم پر اهميت از نظر مقاومت به تنش، ارزش اقتصادي و گستره كشت، اقدام شد. نتايج حاصل از اندازه‌گيري اين پارامترها در قالب يك نمودار هيت مپ نمايش داده شد. در بخشي از كار، كميت بيان هر يك از ژ‌ن‌هاي خانواده CBL در مواجهه با تنش خشكي و حمله ويروس، مورد ارزيابي بيان نيمه‌كمي قرار گرفت. در ادامه نقش احتمالي CBLهاي 3-1 و 3-2 در ايجاد مقاومت به خشكي ارقام حساس و مقاوم گوجه‌فرنگي مورد بررسي قرار گرفت. در اين راستا، گياهاني كه در آن‌ها بيان ژن‌هاي CBL3-1 و CBL3-2با بهره‌گيري از شيوه خاموش‌سازي ژن به روش القائي توسط ويروس، كاهش داده شده بود، تهيه گرديد. بدين منظور بخش‌هايي از توالي CBL3-1 و CBL3-2در ناقل‌هاي ويژه خاموش‌سازي همسانه‌سازي گرديد و پس از واردسازي ناقل در آگروباكتريوم، نسبت به آلوده‌سازي گياهان كنترل و تحت تيمار خشكي با آن اقدام گرديد. اثر خاموش‌سازي ژن‌ها با سنجش پارامترهايي از جمله كميت‌هاي رشدي، محتواي رنگيزه‌اي، پايداري غشاهاي سلولي، H2O2، پرولين، ROS و شماري از آنزيم‌هاي آنتي‌اكسيدان مورد ارزيابي و سنجش قرار گرفت. نتايج بيانگر نقش هر دو ژن مورد مطالعه در پاسخ به تنش خشكي در گياه گوجه‌فرنگي بود. در اين ميان اما، برخلاف نتايج حاصل از مطالعات بيوانفورماتيكي به نظر مي‌رسد كه ژن CBL3-1 نقش پر‌رنگ‌تري را نسبت به ژن CBL3-2در اين زمينه ايفا نمايد. همچنين از نتايج چنين بر مي‌آيد كه اخلال در عملكرد هر يك از اين دو ژن، مستقل از ديگري و مستقل از ساير اعضاي خانواده CBL باعث بروز پاسخ‌هايي در گياه مي‌شود. به عبارتي مي‌توان چنين برداشت نمود كه احتمالاً عملكرد هر يك از ژن‌هاي CBL قابل جايگزيني توسط هيچ‌يك از ديگر اعضاي خانواده CBL يا ساير پيام‌رسان‌هاي وابسته به كلسيم در گوجه‌فرنگي نيست. همچنين نتايج نشان داد پاسخ‌هاي فيزيولوژيكي و بيوشيميايي حاصل از خاموش‌سازي اين ژن‌ها كمتر تحت تأثير رقم گياه قرار مي‌گيرند.

۱۳۹۶/۱۱/۱۴

44891