139پ

GENETIC diversity by use of DNA sequencing and PCR-AFLP with antifungal susceptibility profile for veronaea botryosa

كارشناسي ارشد

بيوتكنولو‍ژي ميكروبي

دانشگاه پيام نور تهران شرق

1394

1394/7/29

بسيار خوب

56ص.

يزدان پرست ، سيد امير

سهرابي ، نوشين

51-54

Drug susceptibility,, DNA sequencing, genetic variation, , AFLP

مخمرهاي سياه يا قارچ‌هاي سياه شبه مخمري به گروهي از قارچ‌هاي هيفوميست با مسيليوم رنگي اطلاق مي‌شوند كه برخي از اعضاي اين گروه از پتانسيل بالائي براي ايجاد بيماري بر روي انسان و ديگر حيوانات برخوردار بوده و به عنوان عوامل بيماريزايي فرصت‌طلب به شمار مي‌روند. توليد رنگدانه ملانين، تحمل درجه حرارت‌هاي بالا و تغيير شكل از فاكتورهاي عمده در بيماريزائي اعضاي اين راسته بر روي انسان به شمار مي‌روند.(25) ورونه ابوتريوسا قارچ سياه شبه مخمري و چند شكلي بوده كه تشخيص آن از نظر ويژگي‌هاي مورفولوژيكي بسيار مشكل مي‌باشد كه از نظر تاكسونومي و فيلوژني اين قارچ در راسته Cheatotyriales قرار گرفته و مرحله جنيني (تلئومورف) Capronia است. با درنظر گرفتن سكانس ژني در ناحيه ITS rDNA اين قارچ شبه مخمري داراي تنوع ژنتيكي كمي بوده كه مي‌تواند در تشخيص دقيق و سريع اين قارچ با ديگر گونه‌هاي وابسته كمك كننده باشد. توالي ژن‌هاي كدكننده پروتئين و ژن‌هاي كدكننده RNA ريبوزومي (rDNA) ناحيه LTS-rDNA زير واحد كوچك (SSU – rDNA) و زير واحد بزرگ (LSU-rDNA) جهت تعيين سطح مختلف روابط خويشاوندي در بين قارچ‌ها مورد استفاده قرار مي‌گيرد.(5و39)از آنجائيكه اين بيماري به دليل منتشره شدن بالا يكي از بيماريهاي تهديد كننده حيات مي‌باشد تشخيص سريع و بموقع و شناسائي عوامل ايجاد كننده به همراه درمان دقيق مي‌تواند از بروز موارد مرگ و مير بكاهد. نمونه‌هاي قارچي مورد استفاده در اين تحقيق قبلاً از منابع مختلف جدا گرديده كه تمام اطلاعات همراه با منشأ جغرافيايي و كلينيكي يا محيطي در جدول يك درج گرديده است. در مرحله اول، جهت بررسي خصوصيات مورفولوژيك جدايه‌ها بايستي بر روي محيط كشت عصاره مخمر آگار كشت داده مي‌شوند. كشت‌ها در درجه حرارت 25 درجه سانتيگرد به مدت 14 روز در شرايط تاريكي نگهداري شده و مشخصات كلني شامل نرخ رشد، شكل ظاهري و رنگ كلني يادداشت مي‌گردد به منظور مطالعه ساختارهاي ميكروسكوپي از تكنيك كشت لام با اندك تغييرات استفاده مي‌شود. براي استخراج DNA جدايه‌هاي قارچي بر روي محيط كشت عصاره مالت آگار بصورت مخطط كشت داده مي‌شد. س از رشد كلني قارچ به اندازه كافي استخراج DNA با استفاده از كيست تجاري (Mobio, USA) مطابق دستورالعمل كارخانه انجام مي‌‌گردد. جهت تكثير ناحيه ITS-rDNA آغازگرهاي ITS1 و ITS4 مورد استفاده واقع مي‌شوند كه اين آغازگرها بخشي از ناحيه ʹ3 زير واحد كوچك DNA ريبوزومي (SSU – rDNA) ناحيه ITS1 و ITS2 و 5.82 و بخشي از ʹ5 از زير واحد بزرگ DNA ريبوزومي (LSU-rDNA) را با استفاده از واكنش زنجيره‌اي پلي‌مراز تكثير مي‌كند. جهت تكثير بخشي از زير واحد بزرگ DNA ريبوزومي (LSU – rDNA) از آغازگرهاي LROR و LR5 مورد استفاده واقع شدند. مخلوط واكنش زنجيره‌اي پلي‌مراز شامل 0.5 واحد آنزيم پلي مراز، بافر واكنش 1 ميلي مول كلريد منيزيم 2/0 ميلي مول از هريك از آغازگرها و 10 تا 15 نانوگرم از DNA بود. كه حجم نهايي مخلوط واكنش با استفاده از دستگاه ترموسايكلر (Gen Amp PCR System) و با اعمال حرارت 95 درجه سانتيگراد به مدت 5 دقيقه جهت واسرشت اوليه و به دنبال آن 36 چرخه شامل 94 درجه به مدت 30 ثانيه 52 درجه به مدت 30 ثانيه و 72 درجه به مدت 1 دقيقه و در نهايت يك چرخه 72 درجه به مدت 1 دقيقه و در نهايت يك چرخه 72 درجه به مدت 7 دقيقه جهت گسترش نهائي انجام خواهد شد.

1395/2/8

31788