جداسازي ژن كيتيناز كلاس 3 از كدو حلوايي ، انتقال آن به آرابيدوپسيس و ارزيابي مقاومت گياهان تراريخت در برابر Alternaria brassicicola

Isolation of class 3 chitinase gene from squash, its transfer to Arabidopsis and eva‎luation of resistance of transgenic plants against Alternaria brassicicola

كارشناسي ارشد

مهندسي كشاورزي - بيوتكنولوژي كشاورزي

پبام نور كرج

93

93/06/30

عالي

115ص.

دهستاني كلاكر، علي

ابراهيمي، محمدعلي

108-114

Cucurbita moschata , chitinase , Transgenic plant , Arabidopsis , gene isolation , Alternaraia brassicicola

پ استاد راهنما مركز كرج

يكي از مشكلات توليد محصولات جاليزي بخصوص گياهان خانواده كدوئيان خسارت بالاي پاتوژنهاي قارچي است كه استفاده بيرويه از سموم را در پي داشته است. از طرفي بعضي از گياهان خانواده كدوئيان مقاومت خوبي را در تقابل با انواع پاتوژنها بروز دادهاند و ميتوان از آنها به عنوان ذخاير ژنتيكي براي اصلاح گياهان زراعي حساس بهره برد. در اين پژوهش تواليهاي ژني كدكننده ژن كيتيناز (chitinase) از كدو حلوايي (Cucurbita moschata) جداسازي شد. براي اين كار از DNA ژنومي به عنوان الگو براي جداسازي توالي مورد نظر استفاده شد. پس از بررسيهاي بيوانفورماتيكي روي تواليهاي مشابه موجود در بانك ژن، پرايمرهاي دقيق و دژنره از تواليهاي اجماعي طراحي شدند و تواليهاي مذكور پس از تكثير با PCR در وكتورهاي TA همسانهسازي و توالييابي شدند. در مرحله بعد پرايمرهاي حاوي سايت برشي XbaI و SacI طراحي شدند و قطعات ژني پس از تكثير مجدد در وكتورهاي دوتاييpBI121 همسانهسازي و پس از بررسيهاي اوليه و اطمينان از صحت آنها، به اگروباكتريوم نژاد GV3850 منتقل شدند. گياهان آرابيدوپسيس با اگروباكتريومها تلقيح و گياهان تراريخت در محيط انتخابي گزينش شدند. سپس اين گياهان با روشهاي PCR و RT-PCR ارزيابي شدند. بررسي توالي نوكلئوتيدي ژن كيتيناز حاكي از آن است كه اين ژن داراي نواحي كد كننده اي به طول 879 جفت بازو حاوي 292 اسيدآمينه مي¬باشد. در بلاست نوكلئوتيدي و پروتئيني و همچنين روابط نشان داده شده در درخت فيلوژنيكي، اين ژن بيشترين شباهت و نزديكي را به كيتيناز كلاس 3 و اسيدي جداسازي شده از گياه Cucumber نشان داد. آزمون PCR گياهان انتخابي نشان داد كه اين گياهان ژن كيتيناز را دريافت كردهاند و آزمون RT-PCR بيانگر نسخهبرداري اين ژن در اكثر لاينهاي تراريخت بود. بررسيهاي اوليه نشان داد تغييرات مورفولوژيك يا فيزيولوژيك خاصي در گياهان تراريخت ايجاد نشده است و نمو آنها مشابه گياهان شاهد غير تراريخت بوده است. عصاره پروتئيني گياهان تراريخته داراي ژن كيتيناز توانست رشد هيف¬هاي Alternaria brassicicola را كنترل نمايد.

74015